禽流感血凝抑制试验

禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与

阴、阳性血清使用说明书

【主要成分与含量】抗原为灭活的H5亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log

2

。阳性

血清为SPF鸡感染禽流感病H5亚型制备的高免血清，HI效价≥7log

2

。阴性血清

为SPF鸡血清。

【性状】抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或

淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型抗体。

【用法与测定】

1、材料

1.1 96孔V型（90°）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加

样槽、吸管、烧杯等。

1.2 PH值7.2 0.01mol/L PBS

1.2.1 配制25倍PB 称量2.74 Na

2

HPO

4

和0.79gNaH

2

PO

4

·H

2

O,，加蒸馏水至

1000m1;

1.2.2 配制1倍PBS 量取40m1 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000m1;

1.2.3 用Na0H或HCL调pH值至7.2;

1.2.4 69Kpa15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤除菌。

1.2.5 PBS一经使用，于2-8℃保存不超过3周。

1.3 阿氏(Aisevers)液 称葡萄糖2.5g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0. O55g、氯

化钠0.42g,加蒸馏水至1OOm来ml，加热溶解后调pH值至6.1， 69Kpa 15min

高压灭菌，2-8℃保存备用。

1.4 1%鸡红细胞悬液采集 采集2-3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的

健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH值7.2 /L PBS液洗涤3次，

每次均以3000rpm/mi n离心5min，洗涤后用PBS配成1% (V/V)红细胞悬液，2-8℃

保存备用。（采5ml鸡血，分置3管，添加盐水6ml，多一点也没关系，充分用

吸管反复吹打混均，放置在离心机离心，把上清液去掉，反复3次。）

1.5 抗原溶解 冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。

2、操作术式

2.1血凝（HA）试验

2.1.1在v型微量反应板中，每孔加0.025m1 PBS。

2.1.2第1孔加0.025m1抗原，反复抽打3-5次混匀。

2.1.3从第1孔吸取0. 025m1抗原加入第2孔，混匀后吸取0. 025m1加入第3

孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025m1弃去。

2.1.4每孔加0.025m1 PBS。

2.1.5每孔加入0.025m1 1% (V/V)鸡红细胞悬液。

2.1.6 将反应板在振荡器上震荡1-2分钟或轻扣反应板混合反应物，在室温

（20-25℃）下静置20-30分钟或2-8℃45-60分钟。在对照孔红细胞显著纽扣状

时判断结果。

2.1.7结果判定 将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪

珠样流淌（100%凝集）的最高稀释倍数为血凝效价。

2.2血凝抑制（HI）试验

2.2.1根据HA试验测定的效价，计算配制4个血凝单位(4HAU)抗原。HA效价除

以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如，HA效价为 1:256，则4HAU抗原的稀

释倍数应是1:64(256除以4)。

2.2.2第1-11孔加入0.025m1 PBS，第12孔加入O.05ml PBS。

2.2.3第1孔加入0.025m1血清，充分混匀后吸0.025m1于第2孔，依次对倍稀

释至第10孔，从第10孔吸取0. 025m1弃去。

2.2.4第1-11孔均加入0.025m1的4HAU抗原，在室温(20-25℃)下静置30分钟

或2-8℃ 50分钟。

2.2.5每孔加入0.025m1 1% (V/V)的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温(20-25℃)

下静置20-30分钟或2-8℃45-60分钟，对照红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。

3结果判定

以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当阳性对照血

清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于2Iog

2

时，试验方可成立。被检血清HI效价≤3log

2

判为阴性；=4log

2

判为可疑(可疑

样品应重检，重检效价≥41og

2

判为阳性，≤31og

2

判为阴性) ≥51og

2

判为阳性。

【注意事项】

（1)HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需

更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。

（2)准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。

（3)用pH值7.0-7.2的PBS作为稀释液。

（4)抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。

（6)准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。

（6)抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2-8℃

保存不超过1个月；可分装成小包装，-70℃冻存，随用随取。切忌反复冻融。

(7)鸭、鹅以及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和抑制素的处理。

(8)同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的

HI效价不同。