pulldown是什么意思ldown在线翻译读音

外语更新时间:2025-05-03 15:40:35

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2023年4月19日发(作者：金卓求)Invitropulldown
Pull-Down技术是通过蛋⽩相互作⽤来研究细胞ppt素材通路的有⼒⼯具。Pull-Down实验是确定两种或更多早发白帝城古诗意思蛋⽩之间相互作⽤的体外
⽅法。Pull-Dow送灵澈上人古诗翻译 n实验可⽤来检测已知蛋⽩的表达和相互作⽤条件，并且可⽤来筛选未知的蛋⽩相互作⽤。Pull-Down实验⾄
少需要⼀种纯化的标签蛋⽩（诱饵）⽤来捕获和“pull-down”靶蛋⽩（猎物）。
Pull-Down vs.免疫沉淀
Pull-Down实验是亲和纯化的⼀种形式，其与免疫沉淀⼗分类似，不同之处在于使⽤诱饵蛋⽩代替了抗体。在Pull-Down实验
中，带有标签的诱饵蛋⽩被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产⽣“次级亲和⽀持物”，⽤于纯化与诱饵蛋⽩相互作⽤的
其他蛋⽩。含有固相化诱饵蛋⽩的次级亲和⽀持物可以与含有推测猎物蛋⽩的各种蛋⽩样品相互孵育。如果缓冲液及样品条件
与靶结合相互作⽤兼容，且诱饵蛋⽩在带有标签和被固相化时仍然可以⾏使功能，那么存在于样品中的猎物蛋⽩就会结合到亲
和⽀持物上。如果特异结合相互作⽤的亲和性⾜够强，那么⾮结合的样品成分可以被洗涤掉，进⽽纯化形式的猎物或诱饵-猎
物复合体可被从⽀持物上洗脱下来。
诱饵蛋⽩固相化策略
1.依赖固相化抗体结合蛋⽩（例如蛋⽩A或蛋⽩G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。必须使⽤其他亲
和系统固相化诱饵蛋⽩（例如‘bait the hook’）。如果有纯化的天然的诱饵蛋⽩，可将其⽤⽣物素进⾏标记或偶联⼀些其他⼩
的标签，以适⽤于现成的亲和树脂。即⽤型⽣物素化试剂及标记试剂盒（见⽬录第九节，281页），可实现使⽤链亲和素琼脂
糖树脂进⾏pull-down实验。
2. 如果被⽤作诱饵的蛋⽩是重组蛋⽩，那么其很可能会含有⼀个⽤于纯化的亲和标签。这个融合标签就会成为该诱饵蛋⽩⽤
于pull-down实验的基础。最常见的标签为⾕胱⽢肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6His），其分别使⽤固相化的⾕胱⽢肽
和固相化的⾦属螯合物亲和配体。接下来的试剂盒被优化⽤于这些特别的亲和系统。列于下⾯⼏页中的Thermo Scientific
GTPase Pull-Down和检测试剂盒，使⽤含有GST标签的特异GTPase蛋⽩的下游效应⼦进⾏检测。
⼀、⽣物素标记Pull-Down实验
实验者须提供⽣物素化蛋⽩作为“诱饵”和表达互作靶标推测蛋⽩（“猎物”）
的细胞。亲和体系是已知且特异的⽣物素-链亲和素的相互作⽤。⽣物素化蛋⽩
作为“诱饵”捕获推测的连接配体（即“猎物”）。在⼀个典型的pull-down实
验中，被固定的诱饵蛋⽩在细胞裂解液中孵育。经过指定步骤的漂洗后，“反应
物”被选择性洗脱以进⾏凝胶分析或Western印迹。因为⽣物素-链亲素和的互
作连接亲和度较⾼，⼀般情况下猎物蛋⽩被洗脱掉，⽽⽣物素化诱饵蛋⽩则仍保
持固定在链亲和素琼脂糖树脂上，不被洗脱。链亲和素琼脂糖树脂
三、多组氨酸 Pull-Do四年级下册语文课本 wn实验
⽤于捕获及纯化与多组氨酸标签融合蛋⽩发⽣相互作⽤的蛋⽩。实验者需提供含
有标签的融合蛋⽩（诱饵）及表达推测蛋⽩相互作⽤靶蛋⽩（猎物）的细胞.
四、活化的GTPase Pull-Down
每个⼩GTPase各⾃的下游效应器的结合结构域均以GST融合蛋⽩的形式表达，当其固相化于树脂之上，可⽤于pulldown（例
如，亲和纯化）活化的或结合GTP 的GTPase。例如，Raf1的GST-RBD（Ras结合结构域）可以pull down活化的Ras。通过
Western Blot对被pull down的活化的GTPase进⾏检测。

使⽤各⾃的Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒检测活化的Ras，Cdc42，Rac1，Rho和Rap1。使⽤GTPS
或GDP处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST 融合蛋⽩及固定化的⾕胱⽢肽孵育。⼀半洗脱下来的pulldown样品（25l）和20g
裂解液通过Western blotting进⾏分析，分别使⽤抗-Rac1，抗-Cdc42，抗-Pan-Ras，抗-Rho 或抗-Rap1抗体。GDP导致的失
活证实了活化的GTPase检测的特异性。
Thermo Scientific活化的GTPase Pull-Down和检测试剂盒与供应商U试剂盒的性能⽐较。使⽤各⾃的试剂盒对GTPS或GDP
处理的NIH3T3细胞裂解液（500g）进⾏Rac1，Cdc42，Ras，Rho和Rap1的亲和沉淀。⼀半洗脱的pull-down样品
（25l）⽤Western blot 进⾏分析。根据⼚商说明书的指导进⾏分析。
Thermo Scientific活化的Rac1 Pull-Down和检测试剂盒的灵敏度。不同量的GTPS处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST-Pak1-
PBD及固定化的⾕胱⽢肽孵育。GDP处理的细胞裂解液（500g）与GST-Pak1-PBD及固定化的⾕胱⽢肽孵育作为阴性对
照。使⽤试剂盒中提供的抗-Rac1的⼩⿏单克隆抗体，对⼀半的洗脱的p幼儿唐诗三百首古诗大全300首 ull-down样品（25l）和20g裂解液通过Western
blotting进⾏分析。
1.先分离膜，然后提取
2.⽤特殊的去污剂选择性分离
1．热变性及酸碱变性沉淀法⽤于选择性的除去某些不耐热及在⼀定PH值下易变性的杂蛋⽩。
2．有机溶剂沉淀法多⽤于⽣物⼩分⼦、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也⽤于蛋⽩质沉淀。
3．等电点沉淀法⽤于氨基酸、蛋⽩质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应⽤较少，多与其它⽅法结合使⽤。
4．⾮离⼦多聚体沉淀法⽤于分离⽣物⼤分⼦。
5．⽣成盐复合物沉淀⽤于多种化合物，特别是⼩分⼦物质的沉淀。
6．盐析法多⽤于各种蛋⽩质和酶的分离纯化。
第⼀节盐析法
⼀般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加⼊中性盐⽽沉淀析出，这⼀过程叫盐析。在⽣化制备中,许多物质都可以⽤盐析法
进⾏沉淀分离，如蛋⽩质、多肽、多糖、核酸等沅有芷兮澧有兰，其中以蛋⽩质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。
盐析法分为两类，第⼀类叫Ks分段盐析法，在⼀定PH和温度下通过改变离⼦强度实现，⽤于早期的粗提液；第⼆种叫b分段
盐析五年级七夕古诗法，在⼀定离⼦强度下通过改变PH和温度来实现，⽤于后期进⼀步分离纯化和结晶。
⼀．影响盐析的若⼲因素1．蛋⽩质浓度
⾼浓度蛋⽩溶液可以节约盐的⽤量，但许多蛋⽩质的b 和Ks常数⼗分接近，若蛋⽩浓度过⾼，会发⽣严重的共沉淀作⽤；在低
浓度蛋⽩质溶液中盐析，所⽤的盐量较多，⽽共沉淀作⽤⽐较少，因此需要在两者之间进⾏适当选择。⽤于分步分离提纯时，
宁可选择稀⼀些的蛋⽩质溶液，多加⼀点中性盐，使共沉淀作⽤减⾄最低限度。⼀般认为2.5%-诗圣是谁哪位诗人 3.0%的蛋⽩质浓度⽐较适中。
2．离⼦强度和类型⼀般说来，离⼦强度越⼤，蛋⽩质的溶解度越低。在进⾏分离的时候，⼀般从低离⼦
强度到⾼离⼦强度顺次进⾏。每⼀组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离⼼收集，再在溶液中逐渐提⾼中性盐的饱和度，使另
⼀种蛋⽩质组分盐析出来。
离⼦种类对蛋⽩质溶解度也有⼀定影响，离⼦半径⼩⽽很⾼电荷的离⼦在盐析⽅⾯影响较强，离⼦半径⼤⽽低电荷的离⼦的影
响较弱，下⾯为⼏种盐的盐析能⼒的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
3．PH值⼀般来说，蛋⽩质所带净电荷越多溶解度越⼤，净电荷越少溶解度越⼩，在等电点时蛋⽩质溶解度最⼩。为提⾼盐析
效率，多将溶液PH值调到⽬的蛋⽩的等电点处。但必须注意在⽔中或稀盐液中的蛋⽩质等电点与⾼盐浓度下所测的结果是不
同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。
4．温度在低离⼦强度或纯⽔中，蛋⽩质溶解度在⼀定范围内随温度增加⽽增加。但在⾼浓度下，蛋⽩质、酶和多肽类物质的
溶解度随温度上升⽽下降。在⼀般情况下，蛋⽩质对盐析温度⽆特殊要求，可在室温下
进⾏，只有某些对温度⽐较敏感的酶要求在0-4℃进⾏。
⼆．硫酸铵的使⽤硫酸铵中常含有少量的重⾦属离⼦，对蛋⽩质巯基有敏感作⽤，使⽤前必须⽤H2S处理：将硫酸铵配成浓溶
液，通⼊H2S饱和，放置过夜，⽤滤纸除去重⾦属离⼦，浓缩结晶，100℃烘⼲后使⽤。另外，⾼浓度的硫酸铵溶液⼀般呈酸
性（PH=5.0左右），使⽤前也需要⽤氨⽔或硫酸调节⾄所需PH。

硫酸铵的加⼊有以下⼏种⽅法：1）加⼊固体盐法⽤于要求饱和度较⾼⽽不增⼤溶液体积的情况；2）加⼊饱和溶液法⽤于要
求饱和度不⾼⽽原来溶液体积不⼤的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸⼊饱和硫酸铵中进⾏透析，
透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提⾼，达到设定浓度后，⽬的蛋⽩析出，停⽌透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析
效果好，但⼿续烦琐，需不断测量饱和度，故多⽤于结晶，其它情况少见。
使⽤固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，⼀般有0℃或室温两种，加⼊固体盐后体积的变化已考虑在表中；
2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋⽩质浓度的变化。⼀种蛋⽩质如经⼆次透析，⼀般来说，第⼀次盐析分离范围（饱和度
范围）⽐较宽，第⼆次分离范围较窄。3）盐析后⼀般放置半⼩时⾄⼀⼩时，待沉淀完全后才过滤或离⼼。过滤多⽤于⾼浓度
硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较⼤，若⽤离⼼法需要较⾼离⼼速度和长时间的离⼼操作，耗时耗能。离⼼多⽤于
低浓度硫酸铵溶液。
第⼆节道士出观有机溶剂沉淀法有机溶剂的沉淀机理是降低⽔的介电常数，导致具有表⾯⽔层的⽣物⼤分⼦脱⽔，相互聚集，最后析
出。该法优点在于：1）分辨能⼒⽐盐析法⾼，即蛋⽩质或其它溶剂只在⼀个⽐较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不⽤脱
盐，过滤较为容易；3）在⽣化制备中应⽤⽐盐析法⼴泛。其缺点是对具有⽣物活性的⼤分⼦容易引起变性失活，操作要求在
低温下进⾏。总体来说，蛋⽩质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
有机溶剂的选择⾸先是能和⽔混溶，使⽤较多的有机溶剂是⼄醇、甲醇、丙酮，还有⼆甲基甲酰胺、