运用NMR研究白蛋白与脂肪酸的相互作用

2024年4月7日发(作者：辽宁鞍山初三数学试卷)

运用NMR研究白蛋白与脂肪酸的相互作用

高东莉;孙鹏;王倩文;刘买利;张许

【摘 要】脂肪酸在哺乳动物的能量代谢中发挥着至关重要的作用,同时也是合成细

胞膜磷脂和其他生物活性化合物的重要物质.脂肪酸在血液中的溶解度很低,主要以

与蛋白质结合状态存在,白蛋白是游离脂肪酸的主要运输者和储存者.因此,研究脂肪

酸和白蛋白的相互作用具有非常重要的医学和生物学意义.本文主要利用基于核磁

共振(NMR)的组氨酸选择性检测技术T2W-RD-WaterLOGSY研究天然同位素丰

度人血清白蛋白(HSA)与脂肪酸的相互作用,结果发现脂肪酸结合前后,HSA的特征

组氨酸谱图变化明显,部分组氨酸信号的相对强度随脂肪酸浓度的增加而不断减小,

相应的滴定曲线分析表明HSA表面有两个强的脂肪酸结合位点.此外,部分谱线的

化学位移变化说明HSA和脂肪酸的强结合还会引发HSA相应的构象变化.

【期刊名称】《波谱学杂志》

【年(卷),期】2018(035)003

【总页数】7页(P338-344)

【关键词】核磁共振(NMR);T2W-RD-WaterLOGSY;人血清白蛋白(HAS);脂肪酸;

组氨酸

【作 者】高东莉;孙鹏;王倩文;刘买利;张许

【作者单位】中国科学院大学,北京 100049;波谱与原子分子物理国家重点实验室,

武汉磁共振中心(中国科学院 武汉物理与数学研究所),湖北 武汉 430071;波谱与原

子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院 武汉物理与数学研究所),

湖北 武汉 430071;中国科学院大学,北京 100049;波谱与原子分子物理国家重点实

验室,武汉磁共振中心(中国科学院 武汉物理与数学研究所),湖北 武汉 430071;波谱

与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院 武汉物理与数学研究

所),湖北 武汉 430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国

科学院 武汉物理与数学研究所),湖北 武汉 430071

【正文语种】中 文

【中图分类】O482.53

引 言

脊椎动物体内含有非常丰富的白蛋白，而人血清白蛋白（Human Serum

Albumin，HSA）在人体血清中含量高达血清蛋白总量的 60%~65%，其主要作

用是调节渗透压.功能上，白蛋白作为转运蛋白可以广泛运载和短暂存储各种内源

性与外源性的化合物，例如转运脂肪酸、影响多种药物的代谢动力学、清理有毒代

谢物、提高血清抗氧化能力等[1].早在 1941年，Kendall等人[2]就首次发现HSA

结合脂肪酸（Fatty Acid，FA）的现象，当时提出“血清中某些染料使白蛋白重结

晶4次之后仍然呈现黄色，怀疑这些染料本质上可能是类脂”.随后的几十年中，

随着科学技术的进步，不断有研究进一步揭示白蛋白结合脂肪酸的能力.晶体结构

显示[3]，白蛋白表面以非对称的形式分布着7个当量的中长链脂肪酸结合位点，

并有着不同的结合强度，表明白蛋白与脂肪酸的作用形式复杂多样.在正常的人生

理条件下，每摩尔HSA大约可以结合0.1~2.0 mol脂肪酸[4].目前，人们对脂肪

酸的摄取主要是饱和脂肪酸，越来越多的研究表明，脂肪酸与许多疾病，包括癌症

的产生都有着密切关系，且游离脂肪酸对机体脂代谢的反应比甘油三酯和胆固醇更

为灵敏，一些重要游离脂肪酸含量的异常变化是病情发展的重要依据.然而由于游

离脂肪酸的水溶性极差，通常需要结合血清白蛋白进行储存和运输，因此对人体血

液中白蛋白与脂肪酸的相互作用研究具有非常重要的意义.

研究表明，在蛋白质与配体的相互作用中，组氨酸（Histidine, His）是常见的活

性中心，具有重要的功能，并发挥着不可替代的作用.这主要得益于其独特的分子

结构，组氨酸有一个咪唑侧链，咪唑环侧链的pKa约为6.0，使得组氨酸的pKa

相对中性，这就意味着在细胞中很小的pH变化都会引起组氨酸的电荷变化[5].正

因为如此，组氨酸在各种蛋白中常作为配体结合位点，同时也作为酶催化的活性中

心，例如促胰凝素的催化功能[6].从本质上讲，咪唑侧链上有两个性质不同的氮原

子，其中一个结合氢原子呈弱酸性，另一个含孤电子对呈碱性，因此组氨酸既可以

作为酸提供质子，又可以作为碱接受质子，还可以同时作为氢键供体和氢键受体.

在生理条件下，组氨酸同时以3种不同的状态存在：一种质子化状态，两种不同

的中性互变异构体状态，多样化的存在形式使组氨酸可以作为亲核试剂、酸碱催化

剂、质子梭子等，因此可作为研究蛋白质动态结构和蛋白配体相互作用的一个理想

探针.

在构成白蛋白的585个氨基酸中，共有16个组氨酸，其中5个位于结构域表面，

分别为domain I的His67、His146和domain II的His242、His247、

His288[7].这些组氨酸不仅涉及白蛋白的构象变化，而且参与锌离子、脂肪酸等配

体的相互作用[7-9]（如图1所示）.不同物种血清白蛋白的序列比对显示组氨酸位

点和数目都高度保守，这更进一步说明了组氨酸在白蛋白生物活性中扮演重要的角

色.因此，研究蛋白质表面组氨酸与配体的相互作用对于我们了解白蛋白结合脂肪

酸的作用机制至关重要.

近些年来，除了晶体衍射，液体核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，

NMR）技术在白蛋白多结合位点研究中应用广泛[10,11].有人通过使用13C标记

的长链脂肪酸，采用1D 13C NMR[12]和2D 1H-13C HSQC[13]等方法观测小分

子以表征不同脂肪酸与白蛋白的结合位点及结合强度.然而，对于白蛋白这样分子

量较大的天然同位素丰度蛋白质，常规手段依然很难直接对其进行观察.一些用于

研究配体与蛋白之间的相互作用的技术，如 WaterLOGSY[14]（Water-Ligand

Observed via Gradient SpectroscopY），STD（Saturation Transfer

Difference）技术等，直接观测参与相互作用的小分子，能够很容易区分出小分子

是否能够结合靶标大分子，因此在高通量药物筛选方向应用非常广泛[15]，但是此

类方法难以获得关于大分子的作用信息，如结合位点等.

图1 白蛋白表面的5个组氨酸及相关配体作用位点（PDB ID: 1E7H）Fig. 1 5

histidines on the surface of albumin and the acting sites of related ligands

(PDB ID: 1E7H)

本课题组前期研究中，在WaterLOGSY的基础上，使用水的辐射阻尼

（Radiation Damping，RD）效应取代选择性脉冲或组合脉冲来完成对水磁化矢

量的选择性激发，降低由此产生的弛豫效应、扩散效应和饱和效应，以提高

WaterLOGSY实验的灵敏度[16].对于单一大分子体系，同时结合横向弛豫加权

（T2 Weighted，T2W）技术，通过调节自旋回波的时间来滤掉蛋白主链宽包信

号，从而保留蛋白分子表面与溶剂分子有快交换或强核Overhauser效应

（Nuclear Overhauser Effect，NOE）的信号，进而获得蛋白质表面组氨酸的信

号，并通过观测其化学位移等随配体浓度的变化，获得相互作用信息.这些工作表

明T2W-RD-WaterLOGSY技术能够大大简化HSA 1D 1H NMR谱，且低场区域

信号大部分来自于白蛋白结构域表面的组氨酸[17].本文在上述工作基础上，对检

测到的HSA表面组氨酸信号进行了部分归属，并将T2W-RD-WaterLOGSY技术

应用于HSA与脂肪酸的相互作用研究.

1 实验部分

1.1 实验试剂

HSA固体粉末（去脂肪酸，纯度>98%）、无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）、二水

合磷酸二氢钠（NaH2PO4⋅2H2O）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）、十六

碳饱和脂肪酸（C16:0）、二甲亚砜（Dimethylsulphoxide, DMSO）和重水

（D2O）均购于Sigma-Aldrich公司.

1.2 样品配制

脂肪酸储液制备：使用分析天平准确称量25.6 mg脂肪酸（C16:0）粉末溶于

500 μL DMSO中，得到200 mmol/L的脂肪酸储液，放入4 ℃冰箱存储备用.

HSA-FA复合物制备：配制终浓度为0.5 mmol/L的HSA于100 mmol/L且pH

为7.40的PBS缓冲溶液中，并与脂肪酸储液一同放入37 ℃恒温水浴锅中温浴5

min，随后在500 μL HSA样品中分别滴加不同量脂肪酸储液使其最终与HSA的

比例（FA:HSA）为0:1、0.4:1、0.8:1、1.2:1、1.6:1、2.0:1、2.4:1和2.8:1，补

加DMSO使其终量均为5 μL以消除DMSO可能对HSA产生的影响，低频超声

后放入37 ℃恒温水浴锅孵化2 h.

将所有样品装入直径为5 mm的NMR样品管中，实验前置于4 ℃冰箱待用.

1.3 NMR实验

所有实验均在Bruker Avance Ⅲ 850型NMR谱仪上采集，对应质子共振频率为

850.3 MHz，实验温度为298 K.

T2W-RD-WaterLOGSY实验在采样之前采用WATERGATE W5序列抑制水峰，

T2W采用CPMG脉冲序列，CPMG总的自旋回波时间为62 ms，极化转移的混

合时间为800 ms，W5脉冲串的时间间隔为60 μs，辐射阻尼效应调控延迟时间

（Δ）为22 ms，等待时间为1 s，采样点数为64 k，累加次数为512，谱宽为

10 204.08 Hz.

2D 1H-1H TOCSY实验的间接维采样模式为States-TPPI，两维谱宽均为8

503.40 Hz，采样数据点阵t2×t1 = 2 048×256，累加次数为32，所有实验的中

心频率均为3 987.92 Hz.

1.4 实验数据处理

实验数据处理均使用Bruker Topspin V3.2软件完成（Bruker Biospin，

Germany），1D自由感应衰减（Free Induction Decay, FID）信号在进行傅里

叶变换之前采用指数窗函数进行处理，线宽因子为1 Hz.

2 结果与讨论

2.1 HSA表面部分组氨酸的信号归属

由于质子灵敏度非常高，且天然丰度同位素含量丰富，因此1H NMR在各种有机

大小分子的结构及动力学研究上应用非常广泛.然而对于分子量较大的蛋白质例如

HSA（分子量为66.5 k），由于各个信号之间重叠严重，谱峰变宽，普通 1D 1H

NMR谱很难得到有用的信息.而T2W-RD-WaterLOGSY技术能够大大简化分子

量较大的蛋白质的1D 1H NMR谱，获得天然丰度蛋白质表面的组氨酸信号.位于

HSA结构域表面的5个组氨酸不仅涉及白蛋白的构象变化，而且参与锌离子、脂

肪酸等配体的相互作用.因此通过选择性检测这些蛋白表面的组氨酸可以简化谱图，

进而对蛋白与配体的相互作用进行研究表征.

分子量较大的蛋白质的横向弛豫时间（T2）较短，2D TOCSY谱适用于检测大分

子量的蛋白质中构象灵活多变的区域，尤其是活泼的氨基酸侧链.组氨酸咪唑环上

的 Hδ2和 Hε1组成特征自旋相关网络（如图2所示），这两个氢核在1H-1H

TOCSY谱图中表现为一组处于NMR谱低场区的交叉耦合信号.我们采集了HSA

的2D TOCSY谱图，并将其低场区域的信号与1D T2W-RD-WaterLOGSY NMR

谱图进行比对，结果如图3所示.从图3可以看到，1D 1H NMR谱中每个峰

（H1~H5）在二维谱中都有相对应的交叉峰.本课题组曾经运用 T2W-RD-

WaterLOGSY方法对HSA做过正常血清pH 7.35~7.45范围滴定和锌离子滴定实

验[17,18].结果显示当pH逐渐升高时，除了δ 7.7处峰无任何变化外，其他峰的

化学位移均向高场发生不同程度的移动.而锌离子滴定实验结果则显示，随着锌离

子的不断滴加，H4/H5峰强度逐渐减小至消失.结合组氨酸特性及我们的TOCSY

图谱，不难得出 H1~H5即为白蛋白结构域表面的五个组氨酸 His67、His146、

His242、His247和 His288.其中His67/His247由于参与锌离子的配位，当锌离

子结合时，N-H交换受限制，信号消失，因此我们推断H4/H5是来自锌离子结合

位点的His67/His247两个残基.

图3 HSA的1H-1H TOCSY谱图. 图中H表示组氨酸, HN（N=1~5）表示同一

个组氨酸咪唑环上两个质子（图2中的Hε1与Hδ2）的交叉峰Fig. 3 1H-1H

TOCSY spectrum of HSA. H represents His, HN (N=1~5) represents the

cross peak between Hε1 and Hδ2 showed in Fig. 2

2.2 HSA与脂肪酸相互作用的研究

正常成年人血清中十六烷酸（C16:0）和十八烷酸（C18:0）含量最高，我们选用

C16:0为代表，对HSA与游离脂肪酸的结合进行研究，使用T2W-RD-

WaterLOGSY技术对HSA进行了脂肪酸滴定实验，结果如图4所示.

晶体结构表明 HSA表面以非对称的形式分布着7个亲和力不同的脂肪酸结合位点，

其中结合位点FA1和FA7分别涉及到两个组氨酸His146和His242的参与[7,19].

根据WaterLOGSY的机制，当脂肪酸逐渐占据 HSA中结合位点的疏水腔，组氨

酸侧链质子与周围水分子的交换会受到影响，在谱图上反映为信号强度的降低.由

图4(a)可以看到，随着脂肪酸比例的增加，5个组氨酸残基中，H1化学位移和强

度均未发生变化，H2和H3的强度逐渐降低，经TOCSY确认，H4和H5的化学

位移从δ 6.63移至δ 6.79，向低场方向发生了非常明显的位移.因此我们推断信号

强度受脂肪酸结合影响的H2/H3很可能是来自His 146或His 242.我们进一步选

择低场H1的信号强度作为参照IR，选择峰形相对清晰独立的H3 [图4(a)中*位置]

的信号强度与其对比得到相对峰强（I/IR），并对该相对峰强的变化与FA:HSA比

例做了拟合曲线.从图4(b)可以看出，在脂肪酸含量相对较少的时候，该峰强度稍

有降低；随着脂肪酸比例的不断增加，在FA:HSA超过1:1时，峰强度变化比较明

显；当比例超过2:1时，峰强度变化再次趋于平缓.表明HSA有2个高亲和的脂肪

酸结合位点优先结合脂肪酸，当脂肪酸添加比例达到2:1时，该位点对脂肪酸的结

合趋于饱和，在其饱和后，才可能有其他结合位点与脂肪酸进一步发生相互作用.

上述结果与Wosilait等人[20]通过理论分析结果基本相符.Wosilait等人模拟发现，

当FA:HSA的生理浓度范围在0.5:1~1:1时，绝大多数脂肪酸是结合在高亲和结合

位点，随着脂肪酸含量的增加会有部分脂肪酸分布到稍弱的结合位点.其中结合优

先次序的差异可能是由于 HSA的酸碱浓度以及构象变化不同而引起的.此外，通过

读取目标峰的相对强度值并对应滴定曲线，我们可以大致判断脂肪酸与 HSA的结

合比例，进而推断游离脂肪酸的含量，为一些疾病的诊断提供参考依据.

图4 脂肪酸滴定HSA的(a)T2W-RD-WaterLOGSY谱及(b)其对应的特征谱线（*）

相对强度随FA:HSA浓度比变化曲线Fig. 4 T2W-RD-WaterLOGSY spectra of

fatty acid titrated HSA (a) and peak intensity of the characterized His (*)

versus FA:HSA concentration ratio (b)

除了峰强度的变化，从图4(a)中我们也可以看到随着脂肪酸含量的滴加，表征锌

离子结合位点的His67和His247[18]信号化学位移往低场方向发生了很明显的位

移.这是由于FA1和FA7处于白蛋白结构域I和结构域II之间，同时又与锌离子结

合位点和药物结合位点I临近，因此这块区域的构象变化非常灵活，脂肪酸的结合

可能引起了白蛋白的构象变化，间接影响了锌离子结合位点化学环境的变化，导致

化学位移的变化.晶体结构同样也表明当脂肪酸结合在 HSA之后，蛋白分子的不同

结构域之间发生明显转动，此外脂肪酸的结合还导致一些氨基酸疏水侧链发生移动，

从而开放了一些以前被这些氨基酸疏水侧链禁锢的结合位点[21].

3 结论

我们将组氨酸选择性检测技术T2W-RD-WaterLOGSY技术应用于研究HSA与脂

肪酸的相互作用，该技术可以检测 HSA结构域表面比较活泼的 5个组氨酸，其中

位于 FA1和 FA7结合位点的His146/His242可以用来表征HSA对脂肪酸的结合.

通过脂肪酸滴定前后谱图的变化我们发现脂肪酸优先进入亲和力高的结合位点，当

脂肪酸结合比例达到2.0时，该位点对脂肪酸的结合趋于饱和，表明HSA表面有

两个高亲和力的脂肪酸结合位点.同时，我们可以参考该曲线判断未知样品中HSA

结合脂肪酸的比例，进而有助于测定血清中脂肪酸的相对含量.

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