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2023年4月18日发(作者：伏尔加河上纤夫)
丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化
[通信作者] *申业，Tel：（010）64014411-2956，E-mail：shenye@；
*黄璐琦，E-mail： huangluqi@ 茉莉酸（JA）和它的衍生物（JA-Ile）
是植物体内广泛存在的一种植物激余秀华经典诗句素，参与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁
迫和次生代谢调控。JAZ（jasmonate ZIM-domain）转录抑制蛋白是JA信号通路
重要成分，在茉莉酸信号传导途径中起着重要的调控作用。通常，植物体内JAZ
蛋白与MYC2等转录因子结合，从而抑制了JA早期反应基因的表达；当植物受
到环境胁迫时，体内具有生物活性的JAs积累，比如JA-Ile[1]，JA-Ile促进
SCFCOI1与JAZ二聚体的结合，形成COI1-JA-Ile-JAZs复合体，随即JAZ被多
聚泛素化，进入到26S蛋白酶体降解，使得有活性的MYC2被释放，从而启动
了茉莉酸响应基因的转录[2]。目前，已经从模式植物拟南芥中分离鉴定了JAZ1
基因家族的12个成员，揭示了JAZ与SCFCOI1形成JA信号通路的核心组件，
并对JAZ与SCFCOI1核心组件对植物生长发育的调控进行了大量研究，但对植
物次生代谢的调控研究较少[3]。
为研究JAZ1在调控丹参酮生物合成中的作用，前期克隆了丹参SmJAZ1基
因的cDNA全长。本文将含有SmJAZ1基因的重组质粒pET32-JAZ1导入大肠杆
菌BL21中，进行体外原核表达，并对诱导时间、温度、IPTG浓度等表达条件
进行优化，得到了JAZ蛋白表达的最适条件，为进一步研究丹参JAZ蛋白通过
响应植物茉莉酸信号途径调节丹参酮生物合成生有热烈分子机制奠定基础。
1 材料
1.1 菌株和质粒
表达宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司，
表达载体pET32由本实验保存。E. coli[pET32-JAZ1]是转化了pET32-JAZ1的大
肠杆菌；仅转化pET32a质粒的大肠杆菌E. coli[pET32a]为对照重组菌。
1.2 酶和试剂
限制性核酸内切酶购自NEB公司；氨苄青霉素和IPTG均购自Sigma公司；
原核表达用非预染蛋白Marker购自Fermentas公司；其他试剂均为分析纯。
1.3 SDS-聚丙烯凝胶电泳
配制SDS-PAGE凝胶（5%浓缩胶，15%分离胶），使用BIO-RAD公司的
Mini-PROTEAN Tetra电泳槽进行重组蛋白的分析 [5]。
2 方法
2.1 SmJAZ1原核表达载体的构建和鉴定
利用限制性内切酶Nco I和Eco RI分别对目的基因JAZ1的PCR产物和原
核表达载体pET32a进行双酶切，将纯化后的PCR产物与表达载体pET32a连接，
重组质粒转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞。涉及到的实验技术均参考文献
[6-7]。用Nco I和Eco RI双酶切鉴定分析，1%琼脂糖电泳检测插入片段大小，
并对阳性重组表达质粒pET32-JAZ1进行测序鉴定。
2.2 [pET32-JAZ1]重组表达菌的诱导表达
挑取阳性重组菌的单菌落，接种于2 mL Amp/LB液体培养基中，37 ℃活化
过夜后，按照1∶50稀释到Amp/LB培养基中，220 rmin-1振摇培养至对数生
长荷塘月色歌曲期（A600 1.0），加入终后汉书的作者是谁浓度为0.4 mmolL-1的IPTG，于30 ℃振摇诱导培养
4～6 h。收集菌体，加入等体积的2loading buffer煮沸，上样，用15%的聚丙烯

酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。
2.3 原核表达条件的优化
针对诱导温度、诱导时间、IPTG浓度，及IPTG添加时间（即诱导起始菌
液浓度）等4个因素对原核表达产物的积累有一定影响，分别分析了这4个因素
对丹参JAZ重组蛋白表达的影响。
2.4 菌液生物量的测定
取培养菌液测定600 nm处的吸光度，作为其生物量标志。
3 结果
3.1 pET32-JAZ1原核表达载体构建
将构建的pET32-JAZ1重组载体转化宿主菌DH5中，PCR鉴定为阳性质粒，
用Nco I和Eco RI进行双酶切鉴定，结果得到了约600 bp的片段（图1），与
SmJAZ1基因大小一致，测序结果显示与目的SmJAZ1基因序列一致，表明已成
功将SmJAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上。
图1 pET32-JAZ1重组质粒双酶切鉴定
Fig.1 Analysis of the recombinant plasmid digesting with restriction enzymes
Nco I and Eco RI3.2 E. coli[pET32-JAZ1]诱导表达
将构建的pET32-JAZ1质粒转化表达菌BL21（DE3）中，加入IPTG诱导表
达，所得菌体经离心煮沸后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，在45 kDa处出现目
的蛋白条带，丹参JAZ1基因的cDNA由642个碱基组成，编码24 kDa蛋白，
原核表达载体pET32a上的His-Tag标签大小为21 kDa，所以重组表达载体编码
蛋白大约为45 kDa；而阴性对照E. coli[pET32a]诱导表达后在45 kDa处没有条
带出现（图2），在21 kDa处出现的条带为His-Tag标签。表明含有SmJAZ基因
的重组质粒，在大肠杆菌中成功表达。
图2 pET32JAZ1原核表达
Fig.2 Analysis of the pET32-JAZ fusion protein expression by SDS-PAGE
3.3 E. coli[pET32-JAZ1]表达条件的优化
3.3.1 诱导时间对pET32-JAZ1蛋白表达的影响保持诱导温度30 ℃，IPTG
浓度0.4 mmolL-1，IPTG添加时间2 h不变，研究诱导时间对pET32-JAZ1蛋白
表达的影响，选择时间点4，6，8，20 h；观察到诱导时间对蛋白表达量有明显
影响，随着诱导时间的延长，蛋白表达量有随之增加的趋势，20 h蛋白表达量最
高（图3）。
3.3.2 诱导温度对pET32-JAZ蛋白表达的影响保持诱导时间6 h，IPTG浓
度0.4 mmolL-1，IPTG添加时间2 h不变，选择4个不同的温度，即20，25，
30，37 ℃，观察到诱导温度对pET32-JAZ1表达影响明显，25～37 ℃均有利于
重组蛋白的表达，而低温20 ℃时蛋白的表达量比较少（图4）。
3.3.3 IPTG浓度对pET32-JAZ1蛋白表达的影响保持诱导时间6 h，诱导温
度30 ℃，IPTG添加时间2 h不变，选择4个不同的IPTG浓度，分别为0.1，
0.4，0.8，1.0 mmolL-1，观察到IPTG浓度在0.1～1.0 mmolL-1对pET32-JAZ1
表达量影响不明显（图5）。
3.3.4 IPTG添加时间对pET32-JAZ1蛋白表达的影响保持诱导时间6 h，诱
导温度30 ℃，IPTG浓度0.4 mmolL-1不变，选择4个IPTG添加时间点，即将
摇过夜的菌液按照1∶50转接后，分别在0，2，4，6 h添加IPTG，观察到不同
的IPTG添加时间对pET32-JAZ1蛋白表达有明显影响；刚转接，随即加入IPTG，
即0 h时蛋白基本没有表达，转接2 h后加入IPTG诱导时的蛋白表达量最高（图

6）。
4 讨论
JAZ蛋白是茉莉酸信号通路的核心组件之一，SCFCOI1/JAZ/MYC2在调控
植物生长发育、生物和非生物胁迫，以及次生代谢物生成中起重要作用。利用分
子克隆方法，对丹参JAZ进行体外重组并大量表达，进而纯化，制备多克隆抗
体，为深入研究JAZ功能奠定基础。
大肠杆菌是常用的融合蛋白质表达系统之一，影响蛋白表达的因素是多方面
的，除了选择合理的表达载体、宿主菌外，还可以通过改变培养条件来实现蛋白
表达量，如改变诱导时间[8]、诱导温度[9]、IPTG添加时间[10]、以及IPTG的
浓度[11]等。本实验选择将目标蛋白SmJAZ1构建到pET32a表达载体转化至E.
coli BL21（DE3）宿主菌中进行蛋白表达，由于pET32a是带有N-端硫氧还蛋白
（）编码序列融合表达载体，在E. coli中以不溶形式存在的蛋白当与
序列融合后，可增加表达蛋白的溶解性[12]；另外，表达宿主菌株BL21
（DE3）能增加存在于胞质中蛋白质的二硫键的形成，使蛋白可溶性更好。
研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白质的表达，控制诱导前细胞密度，
细胞培养温度和诱导后细胞生长时间，可优化外源蛋白质的表达。在成功表达丹
参SmJA七夕节的相关资料 Z1重组蛋白的基础上，分别研究诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、IPTG
添加时间4个培养条件对丹参SmJAZ1重组蛋白表达量的影响。随诱导时间增加，
丹参SmJAZ1蛋白的表达量也随之增加，6，8 h的蛋白表达量没有明显区别，20
h处理的表达量最高，而4 h处理的表达量最低。温度对SmJAZ1蛋白表达的影
响不明显，低温20 ℃的表达量比较少，不利于蛋白表达，30，37 ℃的处理时，
SmJAZ1蛋白表达量没有明显变化。37 ℃培养可能引起某些蛋白形成包涵体，
通常在30 ℃培养会形成可溶的、有活性的蛋白质。不同的IPTG浓度对SmJAZ1
蛋白的表达量影响不明显，所以可以采用低浓度的IPTG浓度0.1 mmolL-1进行
诱导表达，如有文献报道[12]，较低浓度的IPTG诱导使局部的表达蛋白浓度不
会太高，由于原核生物的转录和翻译是同时进行的，缓慢转录使得翻译的蛋白有
条件进行正确折叠，因而能获得较多的可溶性蛋白，细胞生长速率严重影响外源
蛋白质的表达[5]。IPTG添加时间直接影响诱导时宿主菌的密度（A600），在转
接培养后（即0 h测得菌液的A600为0.303 2）立即加入IPTG处理，SmJAZ1
蛋白基本没有表达；转接培养2 h后（即2 h测得菌液的A600为0.9），用IPTG
处理时蛋白已经有了大量的表达，而后随延长转接培养的时间，目标蛋白的表达
量并没有明显的增加，表明将菌液接种到新鲜培养基中培养这一步骤，即加入
IPTG诱导前菌液的生长状态在原核表达中至关重要。
[参考文献]
[1] Chung H S， Abraham J K， Gao X L， et al. Regulation and function of
Arabidopsis jasmonate ZIM-domain genes in response to wounding and herbivory [J].
Plant Physiol， 2008，146（3）：952.[2] Fonseca S， Chini A， Hamberg M， et
al. （+）-7-iso-jasmonayl-L-isoleucine is the endogenous bioactive jasmonate [J].
Nature Chem Biol，2009，5（5）：344.
[3] Staswick P E. JAZing up jasmonate signaling[J]. Trends Plant Sci，2008， 13
（2）：66.
[4] 马歇克，布格斯，布伦南，等. 分子克隆实验指南[M].2版.金冬雁，黎
孟枫，林枫，等译.北京：科学出版社，1996：888.
[5] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T. Molecular cloning， a laboratory

manual [M]. 2nd ed. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989：16.
[6] Liu T， Zhu P， Cheng K D， et al. Molecula朗诵诗歌的背景音乐 r cloning， expression and
characterization of hyoscyamine 6-hydroxylase from hairy roots of Anisodus
tanguticus [J]. Plant Med， 2005，71：249.
[7] Zhang H， Liu Z G， Qu S. Research on optimal expression and purification
of human receptor associated protein in E. coli [J]. J Huazhong Univ Sci Tech（Health
Sci），2004，33：265.
[8] Michael J W， Maria P， Shawn R C， et al. Stabilization of apoglobin by
low temperature increase yield of soluble recombinant hemoglobin in Escherichia coli
[J]. Appl Enxiron Microbiol，1997，63：4313.
[9] Yu G Q， Jiang S Q， Li Y L. Optimizing expression of recombinant
26-kilodalton glutathione S-transferases of Schistosoma jamonicum in Escherchia coli
[J]. Chin J Zoonoses， 2006，22：770.
[10] Baneyx F. Recombinant protein in Escherichia coli [J]. Curr Opin
Biotechnol， 1999，10：411.
[11] Yasukawa T， Kanei I C， Maekawa T， et al. Increase o六国论苏辙翻译 f solubility of
foreign protein in Escheichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin [J]. J
Biol Chem， 1995，270：25328.
[12] Schein C H， Noteborn M H M. Formation of soluble recombinant protein
in Escherichia coli is favoured by lower growth temperature[J]. Biotechnology，
1988，6：291.
Optimizing expression of recombinant jasmonate ZIM-domain
protein from Salvia miltiorrhiza
ZHANG Li-hua1，2， WU Wen-yan2，3， HUANG Lu-qi2*， SHEN Ye2*
（1. School of Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing
100069， China；
2. Institute of Traditional Chinese Medicine， China Academy of Traditional
Chinese Medicine， Beijing 100070， China；
3. School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese
Medicine， Beijing 100029， China）
[Abstract] Objective： Accumulation of tanshinton in Salvia miltiorrhiza are
enhanced by exogenous application of jasmonates. The core JA signaling module
COI1/JAZ/MYC2 play a central role on control of downstream gene expression in the
JA pathway. To obtained the antibody of SmJAZ， SmJAZ recombinant protein was
expressed in Escherichia coli and optimal expression was performed. Method： The
full-length SmJAZ1 ORF was sub-cloned in a prokaryotic expression vector pET32a.
The recombinant fusion protein had high expression level in BL21（DE3） strain of E.
coli， and SDS-PAGE analysis showed its molecular weight was about 24 kDa.
Result： The induction of E. coli [pET32-JAZ1] in different temperature， induction
time， IPTG concentrations and IPTG adding time of E. coli were performed. The
induction time and the induction temperature are positively related trends with
SmJAZ1 protein expression， and IPTG concentration had no significant impact in
protein expression， whereas IPTG adding time had significant impact on protein
expression. Conclusion： Shaking the culture at 30 ℃ until the A600 is

approximately 0.9 （2 h in LB）， and add IPTG to a final concentration of 0.1
mmolL-1， and then the optimal expression of SmJAZ1 recombinant protein were
accumulated after the induction time of 20 h.
[Key words] Salvia miltiorrhiza； JAZ1； prokaryotic expression； optimizing
expression
doi：10.4268/cjcmm20122407