gmer是什么意思r在线翻译读音例句

大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析

摘要:GmeR是一种植物酶学抗病基因,编码的蛋白质具有丝氨酸乙醛酸转氨酶

(SGT)活性,受水杨酸诱导,与大豆霜霉病抗唐诗枫桥夜泊的诗意 性密切相关｡为了进一步研究GmeR基

因的抗病机理,我们利用染色体步移技术克隆得到长为1036bp的GmeR基因5′

上游片段,序列分析显示此片段含有典型的TATA-box､CAAT-box､G-box和as-1顺

式调控元件｡

关键词:GmeR基因;启动子克隆;染色体步移技术;as-1调控元件

CloningandSequenceAnalysisoftheGmeRGenePromoterfromSoybean

(GlycinemaxL.)

Abstract:GmeRwasanenzymaticdiseaseresistancegene,theproteincodedhad

theactivityofserineglyoxylateaminotransferase(SGT),whichwasinducedby

salicylicacid(SA)

ordertoinvestigatetheresistantmechanismofGmeRgene,the1036bp5′up

ce

analysisrevealstha归园田居赏析 titcontainsclassicalTAT秋山二首 A-box,CAAT-box,G-box,whichare

conservedineukaryoticgenepromoters,andothercis-regulatoryelementssuchas

as-1regulatoryelement.

Keywords:GmeRgene;promotercloning;genomewalking;as-1regulatory

element

霜霉病是一种由霜霉菌引起的真菌性植物病害｡植株从幼苗到收获各阶段均可

发病,且以成株受害较重,主要危害叶片,由基部向上部叶发展｡发病初期在叶面形

成浅黄色近圆形至多角形病斑,空气潮湿时叶背产生霜状霉层,有时可蔓延到叶面

｡后期病斑枯死连片,呈黄褐色,严重时全部外叶枯黄死亡｡霜霉病在春末夏初或秋

季连续阴雨天气最易发生,病害严重时可造成20%~40%的产量损失｡该病害在甜

瓜､黄瓜､大豆等一些作物中经常发生｡以大豆霜霉病为例,我国大豆的霜霉病发生

区主要分布在东北和华北地区,在大豆生育期,气候凉爽的地区发病较重｡病害严

重时引起早期落叶､叶片凋枯､种粒霉烂,减产达30%~50%｡幼苗､成株叶片､荚及

豆粒均可被害,带菌种子长出的幼苗可使整个植株发病｡对于霜霉病等植物病害

的防治,最为根本的措施是培育抗病植株｡而与植物抗病性相关的基因则对于抗

病植株的培养有着非常重要的作用｡近年来,越来越多的试验表明组成型表达的

基因在植物的抗病性方面起着重要的作用｡Wang等[1]和Hao等[2]报道调节碳代

谢的腺苷酸激酶秋雨适合发的朋友圈 (Adenosinekinase)和SNF1(Sucrosenon-fermenting-1)与植物的抗

病毒相关｡拟南芥中编码甘油激酶的NHO1基因是抗寄生植物抵抗Pseudomonas

syringae菌必需的,而致命的ae对植物的危害则是通过茉莉酸信号途径抑

制NHO1基因的表达而起作用[3]｡Taler等[4]从野生型甜瓜中克隆了两种同源性

很高的编码丝氨酸乙醛酸转氨酶(Serglyoxylateaminotransferase,SGT)的基因At1

和At2,氨基酸和核苷酸序列比较表明,At1和At2不属于任何一类已知的抗性基因

｡At1和At2在转基因甜瓜中的表达明显提高了丝氨酸乙醛望湖楼下水如天翻译 酸转氨酶､丙氨酸乙醛

酸转氨酶(Alaglyoxylateaminotransferase,AGT)和乙醇酸氧化酶(Glycolate

oxidase,GO)等植物光呼吸中的关键酶的活性和霜霉病抗性｡这些酶的抗病机制被

认为是一种新的防卫机制——植物酶学抗病性(Enzymaticdiseaseresistance,ER)｡

近年来,人们在大豆的霜霉病酶学抗性方面的研究也取得了一些进展｡崔玉瑰等[5]

通过将霜霉病敏感大豆材料黑农10号与抗性大豆材料绥76-5187和绥78-5035

进行遗传比较分析,发现大豆霜霉病抗性是由单基因控制的｡本实验室已从大豆

抗霜霉病抗性品种早丰5号克隆一个新的丝氨酸乙醛酸转氨酶基因

——GmeR(167250),研究证实具有霜霉病抗性｡为了更

好的研究丝氨酸乙醛酸转氨酶抗病机理,从大豆抗性品种早丰5号提取总DNA,

利用Genomewalking克隆了GmeR基因的上游序列并对其结构进行了分析,为进

一步了解GmeR基因的表达调控机制打下基础｡

1材料与方法

霜霉病抗性品种早丰5号种于中国农业科学院生物技术研究所网室,该种子由

国家作物种质中心秋丽娟博士惠赠｡大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5菌株由本实

验室保存｡GenomeWalkerTM

UniversalKit购于Clontechs公司,pMD18-TVector和限制性内切酶均购自于

TaKaRa公司｡

大豆基因组DNA的提取方法为:取25~100mg新鲜大豆叶片,加液氮碾成粉末,

转入1.5mL离心管中｡加450L提取缓冲液(100mmol/LTris-Cl,500mmol/L

NaCl,10mmol/L-巯基乙醇,50mmol/LEDTA,pH值8.0)及100L10%SDS,剧

烈振荡｡65℃水浴30min,加160L3mol/LNaAc(pH值5.2),置冰上20min｡12

000r/min4℃离心15min,取上清｡加2倍体积的预冷的无水乙醇,颠倒混匀以利于

DNA析出｡用玻棒挑出丝状DNA,置于1.5mL小离心管中,70%乙醇漂洗数次后晾

干备用｡

基因组DNA步移文库的构建参照GenomeWalkerTMUniversalKit中的说明书

进行｡基因组DNA分别采用DraⅠ､EcoRV､PvuⅠ和StuⅠ平末端酶消化,酶切产

物与接头连接,构建了4个基因组步移文库(DL1､DL2､DL3和DL4)｡

参照我们克隆并已登陆在GenBank中的GmeR基因的cDNA序列(Accession

167250)和GenomeWalkerTMUniversalKit的要求,设计两个特异引物

PGSP1(5′-AAGAGATGGTTTCTTCCTGGTGCATTG-3′)和PGSP2(5′

-TTCCCTGCCTTCAAATTT

CAAACCTC-3′)｡引物由上海生工生物工程有限责任公司合成｡

大豆GmeR基因启动子克隆分两轮PCR反应｡第一轮PCR反应:在4个0.5mL

的EP管(C1~C4)中分别以构建好的DNA文库(DL1､DL2､DL3和DL4)为模板,

以基因特异引物PGSP1和接头引物(GenomeWalkerTMUniversalKit提

供)AP1(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)在热循环仪(BIO-RAD)上进

行PCR反应｡反应程序为:95℃预变性5min;紧接着7个循环为94℃25s,72℃3

min;然后接着32个循环,94℃25s,67℃3min;最后67℃延伸7min｡反应完成后,

将上述4管PCR产物稀释50倍(D1~D4)用作第二轮PCR扩增的模板｡第二轮

PCR反应:以基因特异引物PGSP2和接头引物AP2(5′-ACTATAGGGCACGC

GTGGT-3′)进行PCR扩增,反应程序为:首先94℃25s,72℃3min扩增5个循

环;紧接着94℃25s,67℃3min扩增20个循环,最后67℃延伸7min｡为了便于结

果的分析,我们根据GenomeWalkerTMUniversalKit中的方法增加了阴性对照和

它提供的阳性对照｡所得最终PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,通过胶回收

纯化后与pMD18-TVector连接,转化5,筛选重组子酶切鉴定,验证后送

中国农业科学院重大工程楼测序部测序｡

GmeR基因5′上游片段序列调控元件用植物顺式调控元件数据库PlantCARE

和PLACE分析｡

2结果与分析

2.1大豆GmeR基因上游DNA序列的克隆

用4个内切酶(DraⅠ､EcoRV､PvuⅠ和StuⅠ)对大豆基因组进行消化,酶切产物

与接头连接用染色体步移技术,经两轮PCR扩增后,从步移文库DL2中克隆启动

子的片段(图1)｡

2.2序列分析

通过测序及序列比较发现该片段与GmeR基因cDNA序列的5′端部分片段重

合,是大豆GmeR基因5′上游区域,片段长度为1036bp｡

采用PLACE若无闲事挂心头 网站(/PLACE/)和Neural

NetworkPromoterPrediction软件以及植物顺式调控元件数据库PlantCARE对克

隆的大豆GmeR启动子序列进行了分析｡结果显示,在+1处C为可能的转录起始

密码子｡预测转录起始位点上游含有3个TATA-box

(-17bp､-47bp和-196bp),3个CAAT-box(-23bp､

-227bp､-341bp)和有3个G-box(-139bp､-214bp､-547bp)｡并且克隆的片断内AT

碱基含量较高,占67.5%｡通过分析发现与生物抗病相关的顺式作用元件为as-1(激

活序列1)顺式调控元件｡该元件位于转录起始位点下游有+236bp和+273bp处(图

2,方框表示),它们的共有序列为TGAC｡

3小结与讨论

植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合､决定基因转录起

始的DNA序列｡植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子ATG(图2,箭

头表示)上游｡植物启动子由核心元件和上游元件构成,如

TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(Initiator)｡从序列分析可

以看出,克隆得到的大豆GmeR基因上游片段含有典型的植物启动子核心元件｡

植物启动子按其转录方式可以分为组成型､组织特异型和诱导型启动子｡当植

物受到真菌､细菌､病毒等病原微生物侵染时,植物体内编码相关保护蛋白质的基

因被激活,从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害,调控这类保护蛋白质的基因

表达的启动子为生物胁迫诱导型启动子[6]｡通过前期的研究发现,GmeR基因编码

的丝氨酸乙醛酸转氨酶与植物抗霜霉病有关,GmeR基因的表达受到水杨酸的诱

导,对大豆GmeR基因启动子的序列分析发现含有as-1顺式调控元件,推测其可能

是水杨酸应答元件,该启动子为诱导型启动子｡

水杨酸是一种植物在逆境反应中起关键性作用的激素[7]｡当病原菌侵染植物时,

体内的水杨酸含量急剧增加而激活抗性基因的转录和表达抗体,从而形成有效的

防御性应答[8],Garretn等[9]研究发现水杨酸通过活性氧作用于as-1顺式调控元

件从而诱导抗病性基因的转录和表达｡Redman等[10]研究发现as-1顺式调控元件

还可以被化学逆境激活,如除草剂､农药､杀虫剂等,并且有组织的特异性,尤其是

在子叶中高效表达｡研究为进一步了解GmeR基因的表达调控机制和植物抗病机

理打下了一定的理论基础｡

参考文献:

[1]WANGH,HAOL,SHUNGCY,inekinaseisina草长莺飞造句 ctivatedby

geminivirusAL2andL2proteins[J].PlantCell,2003,15:3020-3032

[2]HAOL,WANGH,SUNTERG,virusAL2andL2proteins

interactwithandinactivateSNF1kinase[J].PlantCell,2003,15:1034-1048.

[3]KANGL,LIJ,ZHAOT,XIAOF,layoftheArabidopsisnonhost

resistancegeneNHO1withbacterialvirulence[J].ProcNatlAcadSci,

2003,100:3519-3524.

[4]TALERD,GALPERINM,BENJAMINI,Rgenesthatencode

photorespiratoryenzymesconferresistanceagainstdisease[J].PlantCell,

2004,16:172-184.

[5]崔玉瑰,姜成喜,吕德昌,等.大豆霜霉病(Peronosporamanschurica)抗病性

遗传分析[J].大豆科学,1992,11:31-35.

[6]MOUZ,FANW,rsofplantsystemicacquiredresistance

regulateNPR1functionthroughredoxchanges[J].Cell,2003,7:935-944.

[7]FE紫组词语 YSBJ,layofsignalingpathwaysinplantdisease

resistance[J].TrendsGenet,2000,16:449-455.

[8]BrodersenP,MalinovskyFG,HematyK,eofsalicylicacidinthe

inductionofcelldeathinArabidopsisacd11[J].PlantPhysiology,

2005,138:1037-1045.

[9]GARRETONV,CARPINELLIJ,JORDANAX,-1promoter

elementisanoxidativestress-responsiveelementandsalicylicacidactivatesitvia

oxidativespecies[J].PlantPhysiol,2000,130(3):1516-26.

[10]REDMANJ,WHITCRAFTJ,JOHNSONC,candbioticstress

differentiallystimulateas-1elementactivityinArabidopsis[J].PlantCellRep,

2002,21:180-185.