软件设计中嵌入式实时软件的实践论文

下面是小编为大家整理的软件设计中嵌入式实时软件的实践论文，本文共8篇，供大家参考借鉴，希望可以帮助您。

篇1：软件设计中嵌入式实时软件的实践论文

摘要：随着科学技术的不断发展，计算机行业受其影响有很大程度的进步与发展，这使得计算机应用水平不断提高，尤其是嵌入式技术的推出。因为在计算机软件设计中，科学、合理地应用嵌入式实时软件，可以提高计算机软件的质量，降低计算机软件的复杂性，使计算机软件应用更加有效、方便、快捷。所以，计算机软件设计中科学、合理地应用嵌入式实时软件是非常必要的。基于此，文章就计算机软件设计中如何应用嵌入式实时软件进行分析与探讨。

关键词：计算机软件；嵌入式实时软件；实践应用

在嵌入式技术推出之后便得到了人们的高度关注，原因在于嵌入式实时软件应用到计算机软件中可以对计算机系统的硬件和软件有较强的依赖性，并且能够在系统运行的过程中合理控制硬件和软件，保证计算机系统长时间良好运行[1]。由此，可以确定计算机软件设计中嵌入实时软件的应用是非常适合的，不仅能改善计算机软件的应用效果，还说明了计算机软件良好的应用前景。所以，计算机软件设计中嵌入式实时软件的实践应用是非常有意义的。

篇2：软件设计中嵌入式实时软件的实践论文

1.1特点

嵌入式实时软件可以运用在计算机软件的预测指令执行、动态分配、缓存机制等设计中，以此来提升计算机软件系统设计的科学合理性和实时处理功能。当然，嵌入式实时软件之所以能够在计算机软件中充分发挥作用，主要是其核心嵌入式微处理器可以实时支持软件系统的多任务，且在短时间内快速中断，实现多任务操作及计算机存储区保护。嵌入式实时软件应用到计算机软件设计中，包括软件部分和硬件部分，在嵌入式微处理器的作用下，软件与硬件之间可以交互，促使计算机软件系统具有修复功能、检测功能等，从而大大提高计算机软件系统的应用性[2]。

1.2应用原理

嵌入式实时软件在计算机软件中之所以能够有效应用，主要是计算机科学技术和实时处理技术相融合，如此可以形成CORBA模型，加之嵌入式实时软件在计算机软件中可以远程调节等作用的支持，使得计算机软件设计的过程中可以合理地运用CORBA模型，进而科学、合理地规划计算机软件的个各方面，促使计算机软件充分发挥作用。

1.3嵌入式软件的技术特征

基于以上对计算机软件设计中嵌入式实时软件的概述，确定嵌入式实时软件具有以下技术特征。

1.4可靠性

相对于计算机操作系统来说，嵌入式实时软件是一种操作方式，在计算机软件系统中科学、合理地设计嵌入式实时软件，可以提高计算机软件系统的可靠性。因为计算机软件系统中的嵌入式实时软件可以结合计算机软件系统的实际情况，对系统操作任务进行合理分配与调整，并且有效地强化计算机软件系统，如此可以使计算机软件系统在规定的时间内完成各项任务[3]。

1.5系统可靠性

只有安全的工作环境，嵌入式实时软件系统在计算机运行的过程中，才能保证计算机软件系统安全、可靠；反之，将会影响嵌入式实施软件系统的工作效果。所以，为了保证嵌入式实时软件系统在计算机运行中充分发挥作用，一定要设置安全的、良好的外界环境。

1.6时限性

时限性是嵌入式实时软件非常重要的`技术特征之一。主要表现为，在符合时限要求的情况下，嵌入式实时软件系统才能够严格地控制时限，合理地调节软件和硬件，促使两者科学、合理地应用。如若不符合时限要求，那么嵌入式实时软件在处理计算机软件系统任务时将难以严格控制时限，使得计算机软件系统各项任务无法在规定时间内完成。

篇3：软件设计中嵌入式实时软件的实践论文

基于以上对嵌入式实时软件的了解，在计算机的软件设计的过程中要想科学、合理地应用嵌入式实时软件，就要注意强化设计以下方面。

2.1开发流程

出于保证嵌入式实时软件在计算机软件中充分发挥作用的考虑，在具体设置嵌入式实时软件应用的开发流程时应当基于简易性和优越性出发，科学、合理的规划设计。具体的嵌入式实时软件应用开发流程为：首先是基于计算机软件系统应用要求，分析计算机软件需要具备的功能，进而进一步解析嵌入式实时软件。其次，基于嵌入式实时软件应用需要，科学合理地进行嵌入式软件设计和代码生成。再次，在嵌入式实时软件设计方案完成之后对其应用测试，确定依据此设计方案所设置的嵌入式实时软件的应用效果能否满足计算机软件系统应用需要。最后，在确定嵌入式实时软件设计方案符合应用要求的情况下将嵌入式实时软件有效地应用到计算机软件系统当中。按照以上开发流程来进行计算机软件系统开发，的确能够使嵌入式实时软件有效地应用到计算机软件系统中，并且在系统中充分发挥作用，提高计算机软件系统的应用有效性、可靠性、稳定性[4]。

2.2设计要点

计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用是一项比较有难度且容易出现问题的工作。为了保证基于嵌入式实时软件的计算机软件设计方案合理、有效，需要再具体进行计算机软件设计中注意以下设计要点：其一，设计中避免软件和硬件结构相脱离。也就是在计算机软件设计中应当注意嵌入式实时软件的软件部分和硬件部分的有效连接，并且保证后续的设计过程中，都不能将两者拆开，如此才能有效地改善传统计算机软件设计中对硬件依赖过大的情况。其二，在嵌入式实时软件应用设计的过程中，应当注意对嵌入式实时软件的软件部分数据进行初始化处理、数据结构进行格式化处理，保证嵌入式实时软件回归原始状态，达到有效应用的目的[5]。

篇4：软件设计中嵌入式实时软件的实践论文

为了能够具体地说明计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用情况，在此笔者以基于硬件与软件的嵌入式系统开发为例，进行详细说明。其实，基于硬件和软件的嵌入式系统开发，就是利用数字信号处理器、IO设备、C++语言等进行嵌入式实时软件的开发。具体的设计内容是：其一，嵌入式实时软件设计中，因为微处理器是软件的核心，所以先进性微处理器的选择及设置很重要，本次设计中选用的是AT91RM9200型号的微处理器。对此微处理器的设置，重点是外设接口，也就是根据嵌入式实时软件要在计算机软件系统中发挥的作用，合理设置微处理器的功能接口。其二，嵌入式实时软件的开发流程设计中，出于保证嵌入式实时软件应用性的考虑，在进行嵌入式实时软件开发流程设计中，同样是将其分为几个阶段，即分析阶段、设计阶段、代码生成阶段、软件测试固化阶段。为了使嵌入式实时软件满足计算机软件系统的应用需求，设计其开发流程的过程中还要注意将对模块划分及设置放到适合的阶段，以此来保证模块设置合理，能够增强嵌入式实时软件的应用性能[6]。

4结语

在科学技术不断发展的今天，计算机软件系统的应用水平有很大程度的进步。原因就在于嵌入式实时软件的应用。因为在计算机软件设计中，科学、合理的应用嵌入式实时软件，可以提高计算机软件的质量，降低计算机软件的复杂性，使计算机软件应用更加有效、方便、快捷。所以，为了促进计算机软件更加有效地、广泛地应用到各个领域当中，应当致力于嵌入式实时软件的研究，使其在计算机软件设计中获得有效应用，增强计算机软件的应用效果。

[参考文献]

[1]任剑岚.计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用探析[J].信息技术与信息化，（8）：66-67.

[2]宋玉娟.计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用分析[J].城市建设理论研究：电子版，2015（17）：2206-2207.

[3]朱勇.计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用探析[J].信息与电脑，2015（23）：128-129.

[4]肖鹏.计算机软件设计中嵌入式实时软件的运用分析[J].无线互联科技，2015（14）：63-64.

[5]宫婷.计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用探究[J].中国外资：上半月，（12）：280-280.

[6]马宇驰.计算机软件设计中嵌入式实时软件的应用探析[J].信息通信，（4）：104-104.

篇5：嵌入式图像处理系统的软件设计论文

中图分类号：TP3文献标识码：A文章编号：1674-6708156-0080-02

DOI:10.16607/jki.1674-6708.2016.03.049

在很多领域中，由于科学技术的不断发展，不可避免的需要使用大量的数据，面对这些算法复杂的数据，传统的图像处理系统已经不能满足要求。嵌入式图像处理系统在通讯、医药等方面都发挥着非常重要的作用，正是因为各个领域获得的图像数据越来越多，如何对图像数据快速准确的进行处理显得格外重要。所以需要设计出更优化的图像处理。

1嵌入式系统概述

1.1嵌入式系统的概念

嵌入式系统是建立在计算机技术基础上的应用型专用计算机系统，其软件和硬件都可以剪裁，系统对成本、功耗、功能都提出了更高的要求，具有可靠性强、体积小等优点，可以实现对其他设备的监视、控制和管理。随着嵌入式系统的不断发展，嵌入式系统已经渗透到人们的生活中，无论是在工业、服务业还是消费电子等领域都得到了广泛的应用。

1.2嵌入式系统的特点

与普通的计算机系统相比，嵌入式系统的专用性更强，一般是面向特定运用的，嵌入式处理器一般应用在用户设计的特定系统中，集成性高、体积小、功耗低，不仅具有方便携带的优点，操作系统更是实时操作的，可以满足实时性较强的场合要求。将嵌入式系统运用到应用程序中，在芯片上直接运行而不需要操作系统，未来可以充分利用更多的系统资源，用户需要选择RTOS开发平台，保障软件的质量。嵌入式系统主要包括硬件系统和软件系统，其中硬件系统是基础，软件系统是灵魂，复杂程度非常高。

2系统软件设计

基于RF5软件系统总体设计：嵌入式图像处理系统和传统处理系统一样，主要包括硬件和软件两个方面，硬件包括系统的硬件平台，软件包括嵌入式操作系统和图像处理算法两个方面。其中硬件平台又包括图像储存模块、通信模块和显示模块等，主要是为系统的软件系统提供支持。在图像处理过程中，硬件系统可以为其提供计算、显示、存储等条件[1]。RF5是以DSP和XDAIS为基础的代码参考框架，在DSP软件的设计和开发中具有重要的作用，参考框架在整个程序中具有非常重要的作用，是整个运用应用程序的蓝本。RF5的数据处理元素包括通道、单元、任务和XDAIS算法，这4个元素之间具有紧密的联系，独立又联系。嵌入式操作系统是整个系统的核心系统，提供了包括图形处理任务管理在内的各项管理，经过硬件的初始化、图像信息存储、图像信息显示等过程实现图像处理和存储。

3软件模块化程序实现

3.1初始化模块

软件系统的初始化模块主要包括处理器、RF5模块化初始化、图像处理算法、视频捕获、视频显示通道等。处理器和系统板初始化是指设备重启之后，通过软件配置的方式对外围设备进行配置和选择。系统在进行工作的时候，初始化模块是其执行的第一个任务，执行完初始化模块之后，程序的控制权将会转变到调度程序中，由调度程序来调度接下来的任务。

3.2视频捕获和显示模块

3.2.1视频捕获的实现

视频捕获主要负责将外部的视频解码器解码生成的数字视频信号采集收集起来，并且这个采集的过程非常方便，可以实现实时采集，最终形成的图形处理也是可以实时处理的，可以随时随地对大数据的图像进行处理，这也是其最大的优点和特点。采集到的数字视频信号进入到系统外扩的.存储器中，从而实现视频的捕获。视频采集可以自动采集，当单元进入自动采集状态，完成了图像的采集之后，视频端口都会向系统自动发出中断请求，中断服务程序便开始发挥自身的功能，对图像的存储区进行连续更新，图像存储区一旦更新之后，图像采集系统就会采集下一个图像数据，最终进入一个循环。当视频端口的FIFO装满了采集的数据之后，会发生中断信息，进入EDMAISR中断服务程序将视频数据送入到SDRAM中[2]。

3.2.2视频显示的实现

视频显示的实现是通过视频图像显示模块来实现的，视频图像处理模块处理后的图像经过显示模块处理，处理之后将图像编码成数字视频流，标准数字视频流经过系统编码转化为虚拟视频信号，经过解码器之后视频流就变成了标准的模拟视频信号，分别经过EDMA控制器和EDMAISR之后最终进入到视频端口的缓冲区中，经过缓冲器之后，信号会使EDMA中断，送入新的图像信号，并在显示器上显示出来，视频显示的流程。输出作用在外部编辑器中。

3.3图像处理模块

图像处理模块比较灵活，是指在嵌入式的环境下实现对图像的处理。在图像处理系统中，又包括系统功能模块和图像增强模块。系统功能中包含图像增强功能，除了图像功能之外，还包括图像的几何变换、形态运输和图像分析。在图像增强模块中又包括图像的预处理和边缘检测、直方图修正、中值滤波、灰度变换调整，而图像预处理又包括图像平滑和图像锐化。图像平滑就是消除噪声对图像造成的影响，图像平滑的处理是通过高斯低通滤波法来实现，这样做虽然可以消除图像受到噪声的影响，但同时也存在着一定的弊端，图像经过处理之后会变得模糊。图像锐化的目的就是让模糊的图像重新变得清晰。图像模糊是由于图像受到平均或积分运算而造成的，图像锐化就是对其进行逆运算，重新使图像变得清晰[3]。

4结论

嵌入式图像处理系统的软件系统主要包括初始化模块、视频捕获模块、视频显示模块和图像处理模块，在确定了整个软件系统的程序流程之后，就可以分别设计纷纷模块的程序，最终完成整个软件系统的设计。

参考文献

[1]吴锡强.探析嵌入式图像处理系统的设计与实现[J].计算机光盘与软件，2015，12（3）：307-309.

[2]蒋立丰.嵌入式图像处理系统的设计与研究[D].东华大学，2013，22（21）：11-13.

[3]宋琦，牟晓光.嵌入式图像处理系统设计[J].信息技术与信息化，2015，22（31)：116-117

篇6：《嵌入式软件设计》人才培养模式的探索与实践

《嵌入式软件设计》人才培养模式的探索与实践

精讲多练的教学模式,注重理论联系实际,加强实践环节.学生以小组协作形式完成课程系统级项目设计的人才培养模式,在各类专业比赛中取得较好成绩.

作 者：李军 崔怀林 向军 Li Jun Cui Huai-lin Xiang Jun  作者单位：广东技术师范学院计算机科学学院,广东,广州,510665 刊 名：广东技术师范学院学报 英文刊名：JOURNAL OF GUANGDONG POLYTECHNIC NORMAL UNIVERSITY 年，卷(期)： “”(10) 分类号：B503.92 关键词：嵌入式   课程设计   小组协作  

篇7：软件产品库管理在军品开发中的探索和实践论文

软件产品库管理在军品开发中的探索和实践论文

软件“三库”管理是软件配置管理工作的重要内容，产品库作为“三库”中的重要部分，是档案部门在参与军品开发管理的重要环节。本文以笔者所在的军工科研所为背景，结合实际工作，阐述了军用软件产品库在软件生命周期中扮演的角色、做好软件产品库管理的意义，以及开展军用软件产品库管理的实践方法。随着科学技术的迅猛发展，软件作为特殊的商品，已成为制约武器装备发展的核心技术之一。军用软件的特殊性决定了它必须具有严格的保密性、可靠性、有效性，因此必须从软件工程化管理的理念出发，规范军用软件开发全过程管理。在实施软件工程化的过程中，配置管理是关键过程域之一，也是软件质量保证的重中之重。配置管理过程中软件“三库”的建立是关键环节，是软件版本受控的前提和基础，也是确保软件版本可追溯的必不可少的前提条件。

一、认识软件产品库

(一)“三库”的概念和联系

在软件实施开发过程中，把不同时期存储配置的库划分为开发库、受控库和产品库。开发库：开发库用于软件的.设计、编码、调试和内部测试，由项目组管理，项目CM维护，主要放置项目组正在开发但还没被批准的工作产品。受控库：受控库存放评审通过并完成评审缺陷修改后的工作产品，由项目CM管理和维护。产品库：产品库用于存放验收通过后的产品，用于交付、生产等，由档案管理员控制。

软件开发组日常的工作在开发库中开展，当工作达到里程碑时，再迁移到受控库，在受控库中经过更严格的测试后，再上升到产品库，最后发布。配置项在三库之间迁移，一级比一级的控制更加严格。通过权限和流程的控制来实现配置项在不同库的访问。

(二)产品库管理的必要性和重要性

软件的产品库相当于工厂的成品库，它存放的是最终提交给用户的产品。如同其他科技档案在军品科研、生产中的扮演的角色一样，产品库的软件产品在武器装备中具有举重若轻的地位。从软件产品库出去的软件必须是唯一的、现行有效的，如果用于生产的设备安装的是不受控的非法的软件，那么带来的后果不堪设想。

首先，软件是一种数字产品，其复制成本极低，几乎为零，复制过程中不会降低软件本事的质量，与原始版本基本没有差别，而软件版权保护的关键技术，如软件水印技术、加密技术和混淆技术，还不是很完善，并不能给软件真正意义上的安全，这就给盗版提供了机会，不同于传统意义的盗版光盘，这里说的盗版活动是指生产调试人员为了省事而将私自留存的软件自行修改、刻录的行为，如果此类不受控制的软件用于生产，会造成软件故障无法追溯和查询的困境。

其次，软件的复用性和移用性程度高，设计师通过局域网进行软件的共享和传递，一方面造成软件不受控，另一方面，由于安全漏洞的原因，往往造成软件病毒的传播，这对公共调试网和武器装备造成了巨大的危害和损失。

最后，软件与硬件不同，在使用过程中没有磨损、没有消耗，但软件是有生命的，在软件的整个生命周期中，需求专人跟踪、管理。

因此，开展科学合理的软件产品库管理必不可少。

二、软件产品库管理实践

(一)加强技术支持，实现优化配置

为软件开发和管理配置管理工具，因为配置管理是以软件在整个生命周期内建立和维护产品的完整性为目的的，主要用来标识软件配置项，对配置项的修改加以系统控制，建立和维护产品基线库、了解产品基线库的状态，如果缺乏良好的配置管理工具，要顺利进行配置管理工作十分困难。我所应用的是QONE平台，配置项发布、变更都会通过平台通知利益相关方，项目组成员能通过平台了解和掌握软件产品的状态。

在软件产品库的管理过程中，除了硬件工具外，还必须有一套适合自身特点的配置管理程序和制度，并配备完整的三库管理人员。在GJB5000A标准的指导下，结合自身管理特点，编制适合我所的相关规范文件，如《配置项和基线标识规范》《三库管理规范》《变更控制规程》《软件档案管理制度》等。我所在实施软件工程化管理的过程中，成立了软件配置管理组(SCM组)，明确档案人员作为SCM中的软件产品库管理员。软件产品库管理员是本单位最高级别的管理员，其授权也高于开发库和受控库，产品库管理员根据软件规章制度和规范文件，结合档案管理要求，保证产品库软件配置项的归属明确、分类合理、标识明确，确保在实现软件配置项严格控制的同时方便科研人员的利用。

(二)加强产品库的科学管理，确保软件产品的有效控制

为保证产品库内软件的稳定可靠。产品库内的软件在未经审批，不允许对其进行任何删除和更改。产品库中的软件都是已写入了不可擦写的光盘中进行物理归档的，产品库管理员要对其进行一致性、完整性、有效性等一系列检查，具体操作是，根据《产品库物理审核检查单》，对比光盘中的配置项和QONE平台上的软件配置管理计划，以及归档入库单，检查配置项的命名、标识、版本是否符合相关要求。完成检查后还要进行信息录入和光盘备份，然后发布产品库信息并通知利益相关方。

软件产品库的重要性在于它是直接用于生产的，因此必须严格执行出库申请，不能擅自使用产品库以外的软件用于生产和交付。当由于产品交付、生产的需要时，由项目CM申请产品出库，填写《产品库出库申请单》提交部门主管和所级CCB审批。档案管理员根据审批通过的《产品库出库申请单》办理产品出库。

软件产品的更改控制和版本管理是产品库管理的重要工作之一。产品库内的软件一般是不允许更改的，若确须更改，须经用户同意或在用户提出更改要求并经军方领导同意后。由产品库管理员提取软件到受控库，按照受控库中文件更改的相关要求。在履行严格的审批手续后，方能进行更改。更改后的文件，经专家评审确认满足规定的功能和性能要求，并经用户同意和批准后，再次存入软件产品库，从而完成对产品库中软件产品的有效更改。具体做法是：当软件配置项需要更改时，由问题提出者填写《软件问题报告单》，《软件问题报告单》被批准(同意更改)后，由软件开发人员根据《软件问题报告单》填写《软件产品出库单》，配置管理员“拣出”须更改的软件，关闭配置项的发行，并向软件开发人员发布出库通知。当更改和测试完成后，由软件开发人员填写《软件更改报告》，根据评审后通过的《软件更改报告》，软件配置管理员将更改后的程序及相关文档重新“拣入”产品库，配置项版本升级成新的文件版本。

三、结语

在军工企业中，科学有效的产品库管理是提高和保证软件产品质量的有力保障。软件产品库管理是一项系统工程，通过将档案管理和软件配置管理相结合，在软件开发全周期过程中对软件产品状态全过程进行跟踪和管理，从而最终保证电子装备系统的质量。

篇8：实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文

实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文

1993 年，Higuchi 等人将PCR 技术和封闭式检测相结合，对目的核酸数量进行定量分析，提出了荧光定量PCR 技术的概念。1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，达到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技术才得以真正的推广和应用。到目前为止，实时荧光定量已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等科学领域。

1 原理

Real-Time PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号对整个PCR 进程进行实时监测，从而达到对未知起始模板进行定量分析的目的。它是一种将酶动力学、核酸扩增、光谱分析和实时检测技术相结合的技术。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号，这样就可以通过荧光信号强度变化实时监测PCR 产物量的变化，从而得到一条描述PCR 动态进程的曲线，即扩增曲线。

实 时荧光定量PCR 扩增曲线可以分为4 个阶段: 基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，见图1。在基线期( 通常1 ～ 15 个循环) ，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化; 早期指数期，荧光信号超过背景信号并到达阈值( 通常为基线信号标准偏差的10 倍) ，此时循环数称为Ct( Cycle threshold) 值或Cp( Crossingpoint) 值，Ct值与模板起始浓度的对数值成反比线性关系，因而Ct值可被用来定量模板起始浓度; 对数-线性期，在理想反应条件下每经历一个循环，PCR 产物加倍;平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始模板拷贝数。实时荧光定量PCR 能准确地确定初始模板拷贝数，结果重现性好，误差小，与常规PCR 在终点定量上相比更具重要意义。实时荧光定量PCR 结果不仅可以定性( 判断一段序列的存在与否) ，还可定量( 确定基因的拷贝数) ，而常规PCR 只能做到半定量。另外，实时荧光定量PCR 的反应和检测都是在封闭的反应管中进行的，样品污染几率大大降低，无需扩增后的实验操作，大大节省了实验时间，提高了实验效率。

2 Real-Time PCR 定量类型

实时荧光定量分析包括绝对定量和相对定量。绝对定量是对未知样品绝对拷贝数进行测定的方法;相对定量不是测定样品的绝对拷贝数，而是比较样品之间同一目的基因的相对表达量，以期分析样品之间目的基因的表达差异。

2. 1 绝对定量

绝对定量是使用一系列已知浓度( 通常为5 ～ 6个梯度稀释的浓度) 的标准品绘制标准曲线，建立Ct值与起始模板量[总核糖核酸( RNA) 或脱氧核糖核酸( DNA) ] 的对数值之间的线性关系，达到对未知样品绝对的定量。标准曲线的绘制首先是标准品的选择，标准品可以是DNA( 重组质粒DNA、基因组DNA、纯化的RT-PCR 产物及合成的寡核苷酸DNA) 或RNA( 体外转录RNA[5，8-10]) 。但是为了保持与待测样品间扩增效率的一致性，标准品应尽量选择与待测样品结构近似的样品，该方法要求梯度稀释的标准品都必须与待测样品同时平行扩增，且待测样品浓度应包含在已知标准品浓度范围之内。

2. 2 相对定量

相对定量解析方法相对复杂，一般用于基因表达分析。根据选用的标准不同可分为以质量单位为标准的相对定量和以内参基因为标准的相对定量。以质量单位( 细胞的数目或核酸的微克数) 作为标准的相对定量优点是实验设计概念简单，数据分析处理简单易学，缺点是很难准确量化初始材料; 而以内参基因作为标准的相对定量优点是能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料受限时，进行相对表达分析十分方便。缺点是要求得到一个或多个在所有待测样本中恒定表达的内参基因。目前，使用较多的是以内参基因作为标准的定量方法。

2. 2. 1 内参基因的稳定性评价为了确保定量结果的可靠性和准确性，在qRT-PCR 中需选择合适的内参基因对不同样品之间因质量、RNA 的提取效率以及反转录效率不同所产生的差异进行校正，从而实现对不同样品中RNA 的定量和数据归一化。理想的内参基因应满足以下条件: 1) 在不同发育阶段和不同组织器官中表达稳定; 2) 表达不受生物学、实验条件的影响; 3) 其稳定的表达水平与目的基因表达水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的内参基因通常是看家基因( housekeepinggenes) ，然而越来越多的研究表明，看家基因在不同类型细胞和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的，若盲目选择看家基因作为内参，可能会导致基因表达分析结果不准确，甚至得到相反的或者错误的结论。因此选择合适的、稳定的内参用于基因表达的差异分析非常关键。目前，geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等分析方法被广泛用于内参基因的筛选与评价。Xie 等将上述4 种方法整合成一个在线的分析工具—RefFinder，用于各种实验条件下内参的筛选，避免了单个分析方法的片面性。

2. 2. 2 引物的特异性及扩增效率的检测为了使结果准确可靠，qRT-PCR 中还要求引物的特异性好，扩增效率接近100%。刘正霞等研究显示，引物的特异性和扩增效率对定量PCR 结果分析有显著影响。

引物的特异性评估: 引物的特异性可以通过凝胶电泳、PCR 产物克隆测序以及qRT-PCR 的熔解曲线来检查。凝胶电泳的条带若为单一条带，则说明PCR 产物特异性好，若有多条则说明特异性差，需要优化PCR 反应条件和体系或重新设计引物; PCR产物克隆测序结果在去除载体序列后与原序列进行比对，分析测得的序列是否位于上下游引物之间;在qRT-PCR 中，可以通过熔解曲线来判断引物的特异性，若熔解曲线为单峰则说明引物的特异性好。通过上述3 种方法均可以对设计的引物进行特异性检测，以便筛选特异性较好的引物进行后续实验。扩增效率的计算: 相对定量结果的准确性还受到目的基因和内参基因的PCR 扩增效率影响。一般来说，扩增效率接近100%是优化实验使得结果重复性好且可靠的最好标志。实际操作时，反应的扩增效率应该在90% ～ 105%之间，如果扩增效率低，可能原因是引物设计不佳，或是反应的条件没有优化;扩增效率大于100%时，可能的原因有非特异性产物扩增，如引物二聚体、错配等引起的PCR 产物产生。传统计算扩增效率的方法是将已知模板稀释成一系列梯度浓度( 不少于5 个点) ，并进行实时荧光定量PCR 实验，利用拷贝数的对数值和Ct值建立标准曲线。评价标准曲线的优劣有两个指标，相关系数( r) 和斜率。相关系数反映标准曲线的直线性，越接近1 说明直线性越好，定量越精确; 斜率与扩增效率相关，计算公式: 扩增效率( E) = 10( - 1 /斜率) - 1。在PCR 过程中，扩增效率在指数期相对稳定，但是随着循环数的增加，Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸( dNTP) 、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，扩增效率也就越来越趋向于0。通过标准曲线得出的扩增效率不能反映PCR 进程中扩增效率的变化。由于PCR 结果往往是通过Ct值来计算的，由扩增效率引起的最终差异只能反映在Ct值上的变化。

为了减小这种情况引起的误差，在定量时确保各样品浓度值在一系列梯度浓度的范围内，即Ct值在标准曲线范围内。此外，尚有根据PCR 进程中的原始数据或扩增曲线的形状，再基于不同的数学算法开发出来的一些软件来计算扩增效率的。这些算法或软件使得扩增效率的计算更加简单易行，特别是对于那些表达量很低的基因很难通过一系列的梯度稀释来求扩增效率。该方法缺点是不同软件基于的算法不同，因此各软件得到的结果也有差异; 噪音导致可用的数据点很有限，计算的扩增效率也就不精确。

2. 2. 3 数据处理方法对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，在这里只讨论以内参基因为标准的相对定量方法。常用的方法有双标准曲线法、2-△△Ct法、用参照基因的△Ct法和Pfaffi 法，应用每种方法必须对应适应的条件。双标准曲线法: 首先分别对目的基因和看家基因的5 个( 尽量不少于5 个点) 浓度梯度稀释的标准品制作两条标准曲线。各待测样品与标准品同时进行反应，得到目的基因的Ct值，分别代入目的基因的标准曲线，得到看家基因的Ct值，分别代入看家基因的标准曲线，这样就可以换算出各待测样品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用内参对各待测样品进行归一化，即用目的基因的定量结果除以看家基因的`定量结果。最后对不同样品之间目的基因的表达量进行比较，通常将对照样品的表达量作为1，计算出相对量，再进行样品间相对量比较。2-△△Ct ( Livak) 法: 2-△△Ct 法是定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，但条件是目的基因和内参基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5% 以内，否则会产生较大的误差。

使用2-△△Ct 法之前，必须验证目的基因和内参基因的扩增效率。其操作步骤如下: 首先，对所有的待测样品和对照样品，用内参基因的Ct值归一化目的基因的Ct值: △Ct = Ct( 目的基因) - Ct( 内参基因) ; 其次，用对照样品的△Ct值归一化待测样品的△Ct值: △△Ct =△Ct( 待测样品) -△Ct( 对照样品) ; 最后，计算表达水平比率: 表达量的比值= 2 -△△Ct。如果目的基因和内参基因有同样的扩增效率，但是扩增效率不等于2，那么2 -△△Ct 法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。如果目的基因和内参基因扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验。用参照基因的△Ct法: 用参照基因的△Ct法是2 -△△Ct法的一种变化形式，它更容易掌握且结果相同。与2 -△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每个样本之间参照基因与目的基因的Ct值的差值。虽然这种方法的操作步骤简单，但同样也能真实衡量基因表达水平，将参照基因的表达水平计算在内。结果显示，主要的差异是校准样本的表达水平不是1。如果用这个方法得到的表达值除以所选的校准样本的表达值，计算结果与2 -△△Ct 法的结果正好相同，即表达量的比值= 2( △Ct( 内参基因) -△Ct( 目的基因) )Pfaffi 法: 当目的基因和内参基因的扩增效率相近时，用2 -△△Ct法定量相对基因表达是最合适的方法，但是如果两个扩增子扩增效率不同，必须选择另一种方法来确定不同样本之间目的基因的相对表达量。Pfaffi 法则是目前最好的选择方法，计算公式为:表达量的比值= C( A - E) /D( F - B) ( C 和D 分别是目的基因和内参基因的扩增效率; A 和E 分别是对照样品和待测样品中目的基因的Ct值; F 和B 分别是待测样品和对照样品中内参基因的Ct值) 。

2. 2. 4 归一化归一化是对所有样品之间的差异进行校正。不同的样品，即使反应时使用相同量的总RNA，但因细胞来源不同，RNA 总表达量并非一致。因此仅仅将反应时RNA 量统一，起始的细胞数也不一定相同。其实在进行表达量分析时，比较的是相同数量细胞中的某个基因拷贝数目。实际上要将样品材料统一到相同细胞数提取是非常困难的，同时还不能保证RNA 提取效率、反转录效率以及PCR 扩增效率完全相同。基于上述原因，在进行表达量分析时，有必要选择内参基因对所有样品进行归一化处理，以获得目的基因特异性表达的真正差异。

筛选出稳定的内参基因后，先对目的基因归一化处理，然后进行表达差异分析。目前进行归一化分析的方法有两种: 单基因归一化和多基因归一化。实时荧光定量最早被用于基因表达差异分析时，大多文献报道都是以单个基因作为内参基因，对目的基因的表达量进行归一化。然而，基于单一内参基因进行归一化存在许多缺点，可能导致比较大的误差。因此，多个看家基因开始被应用于归一化分析中。

3 在中药领域中的应用

3. 1 基因表达分析

荧光定量PCR 最普遍的应用是基因表达分析。从基础科学研究到实际应用，检测基因表达都是基本的也是很重要的一项工作。Olofsson 等对黄花蒿不同组织中萜类代谢途径上的基因进行表达差异分析，为评估青蒿素的前体对青蒿素产量的影响提供科学参考。植物在生物和非生物胁迫下，基因表达水平的相对变化与次生代谢产物累积相关性的研究越来越受到科研工作者的青睐。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 种诱导子组合诱导丹参毛状根。结果发现，在处理24、36 h 后，SmCPS 的表达量显著上调，次生代谢产物隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的含量也随之显著上升，这表明丹参酮类化合物含量的升高可能与SmCPS 基因表达量的上调有关。在植物的不同发育阶段，其次生代谢产物的累积量及基因的表达水平也会不同。如Kim 等对人参在叶片不同开放期( 闭合阶段、中间阶段、全开放阶段) 其体内人参皂苷及生物合成途径上的关键酶基因进行检测。结果显示，在中间阶段和全开放阶段人参皂苷生物合成途径上的酶基因PgSS 和PgSE 的表达量比闭合阶段增加约1. 5 倍，PgDDS 的表达量则增加4 倍以上; 主根和侧根中，人参皂苷的含量在叶片开放的中间阶段达到最大值，而叶片中人参皂苷的含量在全开放阶段达到最高。此外，实时荧光定量的差异表达分析在中药领域得到广泛应用，如在甘草、黄花蒿等药用植物中都有大量的研究。

3. 2 中药品种及真伪鉴别

中药的真伪直接影响临床用药的准确性和中药的质量，因此对于中药品种真伪的鉴别历来是中药研究中极为重要的工作。Xue 等依据骨碎补的正品及其混淆品trnLtrnF间隔序列，设计Scorpion 探针，通过实时荧光定量对骨碎补的真伪进行鉴别，同时对多个混合样品( 正品中加入一种混淆品，按一定比例梯度混合)建立标准曲线，以分析正品中混淆品的掺入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之间内转录间隔区( ITS) 序列的长度、鸟嘌呤( G) 、胞嘧啶( C) 含量的差异，采用LightCycler 定量仪扩增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各产物的熔解曲线。通过解链温度的差异区分鉴别升麻及其替代品，为快速、稳定鉴别升麻及其替代品建立了标准。董玉茹等将限制性内切酶引入熔解曲线分析中，建立了一种新的单核苷酸多态性( SNP) 分型方法，成功实现了对金银花与山银花、白术与苍术品种及真伪的鉴别。此外，有研究者基于实时荧光定量PCR 技术，分别对铁皮石斛近缘种冒充铁皮石斛以及三七粉掺假等现象建立快速的检测方法。

4 小结

植物在生长、发育及受外界环境刺激等过程中，其基因在不同时空的表达存在着很大差异。对基因的表达量进行差异分析，是了解生物体生长、发育和调控等机理的一个重要内容。Northern 杂交、Southern 杂交和原位杂交等都可以用来进行目的基因的定量分析，但这些方法耗时且敏感性较差。普通PCR 终点定量的缺陷是扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭( EB) 染色后才可以显示出来，这些步骤耗时且不易精确定量。此外，由于酶动力学的特点，在PCR 反应进程中有基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，理论上来说，所有样本的DNA 扩增量最后是相同的，但实际上，不同样本的平台期是不一样的。在这种情况下，通过终点定量分析，反而将反应效率中很小的差别放大出来，造成定量的不准确。实时荧光定量为起始定量，误差相对较小，这使其在定量方面得到快速的发展。PCR 产物长度或组成不同，其熔解曲线( 熔链温度) 也存在差异，因此可根据熔解曲线的差异进行物种的鉴别。中药鉴定要解决其中一个很重要的问题就是真伪。实验过程中，我们可通过设计特异性引物来扩增不同的样品，从而得到不同的PCR 产物，再根据相应的熔解曲线鉴定中药材的真伪和掺伪的中药材。此外，实时荧光定量PCR 还可广泛用于等位基因分析及转基因生物检测等。

实时荧光定量PCR 自建立以来，发展迅速、应用广泛，拥有许多优点。近年来，许多科研工作者基于实时荧光定量PCR 的基本原理对其进行不断地研究和改进，使实时荧光定量PCR 得到了进一步的完善。随着实时荧光定量PCR 的不断标准化，该技术将在生物学、医学基础研究等科研领域中得到更加广泛的推广与应用。